干貨分享：人IgE ELISA檢測(cè)試劑盒應(yīng)用及操做

人IgE ELISA檢測(cè)試劑盒

（酶聯(lián)免疫法）

貨號(hào)：RJ13428

線性范圍：32-2000 ng/mL

1.                      預(yù)期用途

本試劑盒用于檢測(cè)血清、血漿等樣本中人IgE濃度，僅供研究使用。

2.                      檢測(cè)原理 

試劑盒采用雙抗體夾心法原理：將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及校準(zhǔn)品中待測(cè)物，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，結(jié)合形成“抗體-抗原-抗體-HRP"免疫復(fù)合物，加入TMB顯色后，若樣本中有待測(cè)物則顯藍(lán)色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測(cè)過(guò)程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)OD值，顏色的深淺和樣品中的待測(cè)物含量呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中待測(cè)物的濃度。

3.                      包含的實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料

如需單獨(dú)采購(gòu)通用型組分，請(qǐng)?zhí)峁?duì)應(yīng)的組分名稱。

4.                      需要但未包含的實(shí)驗(yàn)材料

·                      蒸餾水或去離子水，一次性離心管、一次性手套等耗材；

·                      移液器、多通道移液器及配套槍頭；

·                      燒杯、量筒、試劑瓶等容器具；

·                      用于封貼微孔板的封板膜或其他替代材料；

·                      微孔板振蕩器（如有需要）、離心機(jī)、旋渦振蕩器等輔助設(shè)備；

·                      恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)。

5.                      試劑的準(zhǔn)備及儲(chǔ)存

·                      1×洗液的配制：濃縮洗液（20×）如有晶體析出，需在37℃下加熱至晶體全部溶解后使用。用蒸餾水1:20稀釋，例如：10mL濃縮洗滌液加入190mL的蒸餾水，混合均勻。

1×通用稀釋液的配制：用蒸餾水1:20稀釋，例如：10mL的20×濃縮通用稀釋液加入190mL的蒸餾水，混合均勻。

1×酶標(biāo)記物工作液的配制：100×酶標(biāo)抗體用“1×通用稀釋液"按1:100倍稀釋，例如：10uL的（100×）酶標(biāo)抗體加入990uL的“1×通用稀釋液"，混合均勻。配制好的1×酶標(biāo)抗體工作液可以在2~8℃保存8h。

·                      工作校準(zhǔn)品的配制：校準(zhǔn)品開(kāi)封前應(yīng)離心30秒，確保所有校準(zhǔn)品集中于底部；

準(zhǔn)備7個(gè)離心管，將10×校準(zhǔn)品按需吸取一定量用“1×通用稀釋液"稀釋10倍配制成校準(zhǔn)品S1。例：50uL的10×校準(zhǔn)品+450uL的“1×通用稀釋液"，制備得到500μL的S1濃度校準(zhǔn)品。在隨后的6個(gè)離心管中分別加入250μL的“1×通用稀釋液"，在這6個(gè)試管中（S2~S7）將S1校準(zhǔn)品依次倍比稀釋6個(gè)梯度至S7，共配制7個(gè)濃度的校準(zhǔn)品，依次為：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7，如下圖所示。“1×通用稀釋液"作為空白校準(zhǔn)品S0。

6.                      樣品采集、預(yù)處理及儲(chǔ)存

·                      血清：使用血清采集管采集全血，室溫靜置待血細(xì)胞凝集后取的血清，或直接在1000×g下離心15分鐘取得血清。操作應(yīng)柔和，避免溶血發(fā)生。獲取的血清應(yīng)及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，如不能及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)等分為多份，儲(chǔ)存在-20℃及以下溫度條件，儲(chǔ)存時(shí)間不超過(guò)6個(gè)月，樣品凍融不超過(guò)2次。

·                      血漿：使用EDTA或肝素采血管收集血漿。全血采集后以1000×g離心15分鐘取得血漿。操作應(yīng)柔和，避免溶血發(fā)生。獲取的血漿應(yīng)及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，如不能及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)等分為多份，儲(chǔ)存在-20℃及以下溫度條件，儲(chǔ)存時(shí)間不超過(guò)6個(gè)月，樣品凍融不超過(guò)2次。

·                      組織：組織稱重后剪碎，將剪碎的組織加入裂解液，一般按1:4-1:9的重量體積比，比如100mg的組織樣品對(duì)應(yīng)400uL的裂解液，具體可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，最后將勻漿液于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測(cè)。

·                      細(xì)胞：取適量細(xì)胞，于冰上進(jìn)行超聲破碎，5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測(cè)。

·                      細(xì)胞上清：取細(xì)胞上清于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測(cè)。

7.                      實(shí)驗(yàn)步驟

使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右，也可置于37℃溫箱快速回溫至室溫。

注意：酶標(biāo)板未恢復(fù)室溫前，請(qǐng)勿開(kāi)封。

* 樣品稀釋液50uL，加樣品50uL樣品稀釋倍數(shù)為2倍。

* 樣品稀釋液80uL，加樣品20uL，則稀釋倍數(shù)為5倍。

* 如樣本珍貴量少，可適當(dāng)加大稀釋倍數(shù)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳稀釋倍數(shù)。

8.                      結(jié)果計(jì)算

雙波長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果無(wú)需進(jìn)行調(diào)0，可直接進(jìn)行標(biāo)曲擬合及結(jié)果計(jì)算。

以下曲線擬合方式均可使用，選擇擬合后r值最佳的擬合方式進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。

l                      四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合：以濃度值為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)；

l                      多項(xiàng)式曲線擬合：2次多項(xiàng)式、3次多項(xiàng)式；

l                      雙對(duì)數(shù)直線擬合：以濃度值取對(duì)數(shù)，吸光度值取對(duì)數(shù)后，進(jìn)行直線擬合；

l                      點(diǎn)對(duì)點(diǎn)擬合：各相鄰點(diǎn)之間分別單獨(dú)進(jìn)行線性擬合，分段計(jì)算；

推薦使用專業(yè)化軟件進(jìn)行結(jié)果擬合和計(jì)算，如ELISACALC、SPSS、Graphpad Prism等。

**最終樣本濃度應(yīng)乘上樣本的稀釋倍數(shù)。

曲線擬合方式示例圖，以下數(shù)據(jù)和曲線僅供示例，與本試劑盒測(cè)定結(jié)果無(wú)關(guān)。

9.                      檢測(cè)的局限性

樣本濃度超出檢測(cè)范圍上，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行適當(dāng)加大稀釋倍數(shù)后再次檢測(cè)，計(jì)算結(jié)果應(yīng)當(dāng)乘上稀釋倍數(shù)。樣本濃度低于LOQ定量，檢測(cè)結(jié)果無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

10.                      產(chǎn)品性能指標(biāo)

以下結(jié)果基于校準(zhǔn)品的濃度值實(shí)驗(yàn)得出，未納入基質(zhì)效應(yīng)等其他因素的潛在影響。

靈敏度：25 ng/mL

精密度：板內(nèi)精密度CV＜10%（N=20），板間精密度CV＜15%（N=20）。

特異性（Analytical specificity）：其他相關(guān)因子在稀釋緩沖液中制備為10μg/mL測(cè)定，沒(méi)有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。?

11.                      注意事項(xiàng)

·                      試劑盒內(nèi)所有成分僅供研究使用！

·                      終止液含稀硫酸，具有腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。

·                      試劑盒成分含防腐劑、蛋白成分等，可能引起皮膚過(guò)敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

·                      顯色劑、濃縮洗液可能引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

·                      佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服、眼睛和面部防護(hù)用品，實(shí)驗(yàn)操作后洗手。

12.                      技術(shù)要點(diǎn)

·                      不同批次的試劑盒不能混用，不建議將不同板上的微孔板條組裝在一塊板上檢測(cè)，盡管是同一批次試劑，也可能存在板與板之間的差異。

·                      每次實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)當(dāng)始終配制標(biāo)準(zhǔn)曲線平行檢測(cè)，不能將上一次的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于下一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算。

·                      不要使用超過(guò)有效期的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

·                      底物顯色劑應(yīng)當(dāng)為無(wú)色，如變藍(lán)表明已變質(zhì)，不能應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。

·                      使用適當(dāng)?shù)姆獍迥っ芊馕⒖装鍡l，以便檢測(cè)結(jié)果更加可靠。

·                      操作時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡。不要將不同試劑瓶的瓶蓋交叉使用。

·                      應(yīng)當(dāng)遵循說(shuō)明書的操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不按照說(shuō)明書的操作將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變化，任何不遵循說(shuō)明書的實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)當(dāng)事先詢問(wèn)售后技術(shù)支持的建議。否則我們不保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠。